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幽门螺旋杆菌的免疫学检测 组合

百岁啦体检网 • 2016.07.19 16:32

  幽门螺旋杆菌的免疫学检测检查组合

  幽门螺旋杆菌的免疫学检测简介:幽门螺杆菌免疫学检查是通过测定血清中的幽门螺旋杆菌抗体来检测幽门螺旋杆菌感染,包括补被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定(ELISA)等。

  检查部位:胃

  空腹检查:否

  幽门螺旋杆菌的免疫学检测注意事项

  不适宜检查人群:无

  检查前禁忌:注意保护好脑部;准备好各种包装液,并配置好浓度。

  检查时禁忌:1.患者取脑脊液坐好,以免弄伤头部。

  2.所用单克隆抗体致敏羊血红细胞要冻干才使用。

  3.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

  4.显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。

  5.DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。

  6.严格控制影响标记效率的因素如温度、时间、pH、酶和抗体量等。

  7.装层析柱时要使柱体均匀、柱面平整,无气泡、裂隙。

  幽门螺旋杆菌的免疫学检测检查过程

  一被动血凝测定

  患者刺取脑脊液,采用稀释抗原固定血清法用96孔V型微量血凝板, 将乙脑抗原作倍比稀释, 使每孔含25uL, 被检血清用稀释液作1:10稀释, 每孔加人25uL产, 再滴加冻干乙脑单克隆抗体致敏羊血红细胞25uL,37℃下放置数小时后观察结果。

  二免疫印迹技术

  (一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。

  (二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。

  (三)转移:(半干式转移)

  1.电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。

  2.膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。

  3.转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。

  (四)免疫反应:1.用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。

  2.加入包被液,平稳摇动,室温2hr。

  3.弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。

  4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。

  5.弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。

  6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。

  7.弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。

  8.加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

  三酶联合吸附测定:

  常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。

  1.间接ELISA

  本法主要用于检测抗体。间接ELISA的操作程序如下。

  (1) 材料

  ① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;

  ② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清.

  ③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

  (2) 方法步骤

  ① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干

  ③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干

  ④ 加底物液 → 37℃ 30分钟,加终止液

  ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值。

  2.双抗体夹心ELISA

  本法主要用于检测大分子抗原。

  ① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干

  ③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干

  ④ 加底物液 → 37℃ 15分钟,加终止液

  ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

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